当菌种保藏技术的应用上

菌种保藏技术的应用(上)

微生物的生长周期短，能用工业生产，但是人为的不断传代伴随而来的缺陷是容易引起遗传变异。因此，从30年代开始就有菌种保藏的研究报告，并探索出了很多方法。许多国家都已建立了专门的菌种保藏机构，如美国标准菌种收藏所（ATCC）、英国的国立标准菌种收藏所（NCTC）、日本大阪发酵研究所（LFO），还有全球性的世界微生物保存联盟（WFCC）。这些机构都出售和交换菌种并出版菌种目录。全世界的菌种保藏机构在300个以上。我国在1979年成立了中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），制订了组织和管理条件并设立6个保藏中心。菌种保藏的目的明确，在基础研究工作中，同一菌种在工作过程及结束后，均可获得重复的实验结果。对于有经济价值的生产菌，需要保持其高产的性能。通过生物工程技术所得的重组菌必须保持其遗传特性的稳定性。总之在保藏期内，既要随时可以使用这些菌种，又要尽可能减少甚至不产生遗传变异。本文介绍几种菌种保藏的方法。

1． 斜面保藏法

这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌及放线菌都可应用。当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，一般在4℃左右可保藏3~6个月。到期后重新移种一次。当然保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种甚至在37℃保藏为宜，也有的需要1~2周传代一次。这种方法的弊端是传代次数多了容易发生变异，如产生孢子能力下降、发酵能力减弱、毒力减小甚至基因失落等，传代次数多也容易使污染机会增加。目前许多实验室采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的棉塞和减少碳水化合物的含量的方法，更有利于菌种的保藏。

2． 穿刺保藏法

此法是斜面保藏的一种改进方法，常用于保藏各种需气性细菌。方法是将培养基制成软琼脂（琼制定拉力机本方案脂含量为斜面的1/2，一般为1%），盛入1.2×10cm的小试管或螺旋口小试管内，高度为试管的1/3。121℃高压灭菌后不制成斜面，用针形接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。培养后的微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长。然后覆盖以2~3mm的无菌液体石蜡。液体石蜡必须高压灭菌2次。这样的小管可在冰箱中保存以减少微生物的代谢作用。因此保藏效果较斜面为好。如果不用穿刺法而直接将液体石蜡加入生长好的斜面上亦可得到相似的效果，而且适用的范围较广，真菌放线菌都可适用。但发现液体石蜡减少应及时补充。穿刺法及液体石蜡覆盖法都很简便，但保藏期却因微生物种类不同而有很大的差异，真菌有的可保藏达10年之久，对一些形成孢子能力很差的丝状真菌，液体石蜡覆盖法行之有效。而另一些菌种如固氮菌、分支杆菌、沙门氏菌、毛霉等却不适宜。此外，从液体石蜡覆盖层下移种时，接种针在火焰上烧灼时菌体会随着液蜡四溅，如果培养物是病原菌时，应予注意。第一代的培养物会有液蜡的残迹和复壮问题，第二代才适于实验用。

3． 干燥保藏法

这种方法适用于形成芽孢子的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。其原理是将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。一般将园土或耕作土研细、过筛（24筛目），干燥后使用，也可以用沙子过筛后以氢氧化钠和盐酸交替洗净后作为载体。在1.2×10cm小试管内盛入土壤或砂子至1cm高度，121℃高压灭菌2~3次。细菌可加入浓的悬液，真菌和放线菌可直接刮下孢子混和，大体上目测载体稍有湿润即可。小试管放入真空干燥器中或在干燥器中加五氧化二磷作为吸水剂干燥，试管口可熔封亦可用石蜡封口后，仍放在干燥器械内在5℃保藏。其保藏期一般为2年，有些微生物可长达10年之久。室温保藏效果较差。使用时，只需将少量土壤或砂子均匀倾倒在斜面上，生长好后再移种一次供使用。除了用土壤或砂子作为载体外，亦可使用6~12筛目过筛的硅胶、磁珠或多孔玻璃珠、以2） 圆形试样试样直径ф： 2～20mm及曲子和麦粒来代替，硅胶必须是无色的，着色的硅胶指示剂对微生物有毒性，在硅胶中加入菌液时由于生产吸附热，温度会相应增高，接种时要将盛有硅胶的小试管置于水中冷却。砂子及土壤是更为常用的载体。

4． 悬液保藏法

悬液法的基本原理是将微生物悬浮于不含养分的溶液如蒸馏水、0.25M磷酸缓冲液（Ph6.5）或生理盐水中保藏。适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。大部分能保藏1年或更长。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口试管或一般试管加橡皮塞以防止水分的蒸发。保藏在4℃、10℃或室温（18~20℃）。目前国内生产厂应用玉米发酵醪在冰箱中保种，接种时即将老的发酵醪接入新鲜玉米醪，经热处理后进行保温培养。

5． 液氮保藏法：液氮罐在目前来说已是实验室较容易购置。用液氮罐来保藏菌种，效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛。其方法是将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，细菌加入最终浓度为10%的甘油或5%二甲基亚砜（DMSO（作为防冻的保护剂灭菌后加入）高纯稀土化合物pH7.6。这种营养明胶可制成良好的细菌悬液，许多细菌可保藏4年之久。此法操作简便但无菌要求较高。

6．梭-氏（Sordelli）[4]真空干燥保藏法：此法的基本原理是将小试管中的菌液，不经过冷冻而直接抽干保藏。一般用0.8×6cm有棉塞的小试管，加入以脱脂牛乳等分散剂制成的细菌悬液。悬液中细菌的浓度应高而加入小试管的数量应少，一般不超过5滴，将小试管振荡使悬液附于管壁，贴上标签后，放入12×150cm的大试管中，大试管底部加入少量五氧化二磷及几粒小玻璃珠使小试管不直接与干燥剂接触。大试管的口上配有中间插有玻璃管的橡皮塞。将真空泵与橡皮管联接，抽真空至0.05托左右。可以用石蜡将橡皮塞和玻璃管全部封住，也可以在橡皮塞下部将大部试管拉细，第二次抽真空熔封。在5℃低温下保藏时，NCTC曾报道保藏了2724个菌种，14年后的存活率为83%。酵母及丝状真菌可保藏数年，但对一些敏感的菌珠不适用。

7．真空干燥保藏法：此法是在较高的真空度下，将液态样品直接减压干燥，常被称为L-干燥保藏法（drying from the liquid state的简称）。对于病毒、噬菌体、有些螺旋体效果胜于冷冻干燥法。细菌和酵母亦能使用。在安瓿管中加入1～2滴微生物悬液，切除管口棉塞并将棉塞部推入安瓿管内以便在棉塞上端将管子拉细。棉塞的松紧是操作的要点。这样的安瓿管直接装在孔管上用真空泵减压干燥，其真空度约至0.1托时表在同基本干燥后，再抽1h即可熔封。样品的温度有的是维持在20℃水浴中，有的装置可使温度降至10℃，但总不会达到冰点。干燥的时间需要10～20h或过夜。这种方法可能因使用不多，保藏期限报道较少。噬菌体的保藏期为5年左右。